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      PureFocus850助力透射偏光顯微鏡、相差顯微鏡和微分干涉相差顯微鏡
      
                    
      
                        
      2024-10-25 18:26:48
      
                        
      虹漸光電
      
                        
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      硬件自動(dòng)對焦如何應(yīng)用于專業(yè)的生命科學(xué)顯微鏡技術(shù)？
      

      在上一篇文章中，我們談到了最常規(guī)的生命科學(xué)顯微鏡技術(shù)，并探討了我們的硬件自動(dòng)對焦設(shè)備 PureFocus850 如何與這些技術(shù)聯(lián)用和它能帶來的優(yōu)勢?，F(xiàn)在，我們將探索其他幾種常見但更為專業(yè)的技術(shù)，它們的光路中包含更多的光學(xué)元件。盡管對于硬件自動(dòng)對焦等光學(xué)設(shè)備來說，這似乎是一種挑戰(zhàn)，但我們講解了 PureFocus850 是如何在設(shè)計(jì)時(shí)就考慮到了這些技術(shù)，以及如何避免可能與這些光學(xué)元件產(chǎn)生的沖突。
      

      偏光顯微鏡
      

      偏光顯微鏡是專業(yè)的技術(shù)之一，可用于觀察特殊的生命科學(xué)樣品。它依靠起偏器將白光線性偏振至特定方向后穿透樣品，再依靠檢偏器（另一個(gè)線性偏振器）來篩選偏振角被樣品改變了的光線。任何未被樣品改變的光或者來自顯微鏡周圍環(huán)境的光都會(huì)被檢偏器阻擋。起偏器和檢偏器通常處于正交檢偏位，旨在最大限度地消除任何未被改變的光。光的偏振方式有很多（例如圓偏振），但出于本文的目的，我們將僅對線偏振進(jìn)行講解。
      

      什么是線偏振？
      

      光可以被看作是一種波。偏振是指振動(dòng)的方向垂直于波的傳播方向。白光是非偏振的 —— 光波在任何可能的方向上振動(dòng)。起偏器只允許以特定方向振動(dòng)的光通過。因此，在偏光顯微鏡下，樣品僅會(huì)被具有特定偏振的光照射。
      

      偏光顯微鏡下，樣品將顯示其雙折射性 —— 線偏振光在穿透樣品時(shí)將發(fā)生“雙重折射”，產(chǎn)生兩束彼此呈 90° 偏振的光線。在穿過檢偏器時(shí)，這些光線組分會(huì)相互干涉，進(jìn)而增強(qiáng)樣品特定區(qū)域的對比度，并使其因特性的不同而呈現(xiàn)不同的顏色。天狼星紅是一種病理學(xué)染色劑，可用于檢測纖維變性，并且會(huì)使膠原蛋白在偏振光下呈現(xiàn)紅色。對于未染色樣品的成像，偏振也大有用處，例如辨別痛風(fēng)晶體或者分析巖石樣品。
      

      偏光顯微鏡可以使用硬件自動(dòng)對焦嗎？
      

      當(dāng)然可以 —— 只需調(diào)整自動(dòng)對焦系統(tǒng)的安裝，避開顯微鏡檢偏器的影響即可。檢偏器之所以成為障礙，是因?yàn)橛布詣?dòng)對焦系統(tǒng)用于獲取焦點(diǎn)的激光源所發(fā)出的也是偏振光。很多自動(dòng)對焦系統(tǒng)是安裝在顯微鏡相機(jī)端口上的，而顯微鏡的檢偏器會(huì)阻擋自動(dòng)對焦激光源。
      

      但是，PureFocus850 是安裝在顯微鏡的無限遠(yuǎn)空間內(nèi)的，因此可以兼容偏光顯微鏡。應(yīng)該將其安裝在偏光顯微鏡的物鏡和檢偏器之間以避開干擾。大多數(shù)商用顯微鏡都可以將檢偏器安裝在 PureFocus850 和顯微鏡相機(jī)或目鏡之間。
      

      相差、浮雕相襯和梯度相襯
      

      生命科學(xué)樣品通常是透明的。在過去，研究者們通過染色來提高不同樣品特征與背景之間的對比度。然而，著色過程不僅非常耗時(shí)，還會(huì)降低樣品質(zhì)量并且無法進(jìn)行活體樣品成像。隨著時(shí)間的推移，產(chǎn)生對比度的技術(shù)也在不斷發(fā)展迭代，出現(xiàn)了相差、浮雕相襯（霍夫曼調(diào)制）和梯度相襯等技術(shù)。
      

      雖然這些技術(shù)使用了不同的組件，但它們都基于相同的原理，即將穿過樣品后光的相位差轉(zhuǎn)換為光強(qiáng)度差，從而提高顯微鏡觀察的對比度。相差技術(shù)依靠的是光線穿過樣品時(shí)所產(chǎn)生的相移，以及成像時(shí)相移光和非相移光之間的干涉。浮雕相襯和梯度相襯則依賴于由樣品內(nèi)局部區(qū)域的厚度差異所產(chǎn)生的相位梯度，使光偏轉(zhuǎn)到光學(xué)元件上具有不同透射特性的不同區(qū)域。這兩種技術(shù)都能在圖像中凸顯出存在相位差的區(qū)域，與“背景”形成鮮明對比，也就是樣品中未產(chǎn)生相位差的部分。
      

      什么是相位差？
      

      簡單地說，當(dāng)光從一種介質(zhì)（或折射率）傳播到另一種介質(zhì)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生相位差。將光視為一種波，那么光所通過的介質(zhì)的變化會(huì)改變光波周期中的點(diǎn)。諸如細(xì)胞膜和其他細(xì)胞器等各種細(xì)胞特征結(jié)構(gòu)就可以被劃分為不同的介質(zhì)。利用光線穿過這些特征時(shí)產(chǎn)生的相位改變，各種技術(shù)中所使用的光學(xué)元件就能夠產(chǎn)生可在顯微鏡下觀察到的對比度（信號幅度的差異）。
      

      這些技術(shù)中所有的特殊組件都不會(huì)影響 PureFocus850 的功能，因?yàn)?PureFocus850 的激光不會(huì)與這些組件相互作用。盡管更高的對比度會(huì)使基于相機(jī)的自動(dòng)對焦更容易實(shí)現(xiàn)，但對于高通量應(yīng)用而言，硬件自動(dòng)對焦的速度依然更具優(yōu)勢。由于相差技術(shù)通常會(huì)涉及到活細(xì)胞成像，而且現(xiàn)在，往往會(huì)配合人工智能，用于在未做熒光標(biāo)記或染色的情況下表征細(xì)胞器和其他細(xì)胞內(nèi)特征，因此 PureFocus850 還可以支持延時(shí)實(shí)驗(yàn)或高內(nèi)涵篩選應(yīng)用，而在這些應(yīng)用中，丟失焦點(diǎn)可能會(huì)造成數(shù)小時(shí)的時(shí)間浪費(fèi)。
      

      微分干涉相差
      

      微分干涉相差（DIC）利用了多種相差顯微鏡技術(shù)和偏光顯微鏡技術(shù)，用于在透明或弱對比樣品的成像中產(chǎn)生對比度。該技術(shù)的光路較為復(fù)雜：
      

      1、將顯微鏡光源發(fā)出的光線偏振至 45° 
      

      2、偏振光進(jìn)入 Nomarski-Wollaston 棱鏡，并被分成兩束彼此呈 90° 
      

      3、偏振的光線。兩束光線被剪切并穿過樣品 —— 它們穿過樣品中臨近的兩點(diǎn)。
      

      4、當(dāng)兩點(diǎn)處樣品的折射率或厚度不同時(shí)就會(huì)使兩束光線產(chǎn)生相位差。而相位差的大小則取決于折射率或厚度差異的大小。
      

      5、穿過樣品后，光線經(jīng)過第二個(gè) Nomarski-Wollaston 棱鏡并被重新合并成一束光線 —— 由第一個(gè)棱鏡引起的剪切被第二個(gè)棱鏡消除。重新合并而成的光線偏振方向仍然不同，所以不會(huì)發(fā)生干涉。
      

      6、重新合并而成的光線穿過檢偏器，將其中兩束光線的偏振轉(zhuǎn)入同一平面，并產(chǎn)生干涉。在樣品引發(fā)了相位差的區(qū)域，光線將發(fā)生相長干涉或相消干涉。而在沒有引發(fā)相位差的情況下，則不會(huì)發(fā)生干擾。這種干擾差異會(huì)在圖像中產(chǎn)生類似 3D 的效果，凸顯出不同的特征。
      

      這種干涉所產(chǎn)生的效果與相差顯微鏡技術(shù)類似，但是避免了通常與相差有關(guān)的明亮光暈偽影。與其他技術(shù)相比，該技術(shù)的軸向（ Z 軸）分辨率也更高。
      

      PureFocus850 可以在掃描大面積區(qū)域或多孔板時(shí)確保對特定焦平面的高度專注，因此顯微鏡專家們能夠充分地利用 DIC 的高軸向分辨率。與偏振光顯微鏡的安裝方式相同，PureFocus850 必須放置在物鏡和檢偏器之間，而所需的其他組件（尤其是 Nomarski-Wollaston 棱鏡）則不會(huì)影響其性能。盡管 PureFocus850 激光會(huì)兩次穿過棱鏡（前往樣品和從樣品返回），但激光的分割和重新合并不會(huì)顯著影響 PureFocus850 傳感器上的信號強(qiáng)度。
      

      想了解 Focus850 如何幫助您的應(yīng)用？
      

      如本文和前文所述，PureFocus850 能夠兼容大多數(shù)的生命科學(xué)顯微鏡技術(shù)。請與我們聯(lián)系，探討您的需求或者您想要升級的顯微鏡。
      

      PureFocus850 可以兼容使用反射光的工業(yè)顯微鏡技術(shù)嗎？
      

      在本文中，我們重點(diǎn)關(guān)注了透射光生命科學(xué)顯微鏡，但 Purefocus850 也完全兼容反射光顯微鏡技術(shù)，包括前文中討論過的熒光技術(shù)。在未來的文章中，我們將探討在使用反射明場、暗場、DIC 以及其他技術(shù)的工業(yè)顯微鏡中，PureFocus850 為何是一款強(qiáng)大的工具。您將在文中了解到 PureFocus850 如何提高了晶圓掃描的通量。
      
                    
      
                    
                
      
            
      
        
      
    
      
    
      
    

      

      
    
      
    
      產(chǎn)品中心
      

      

      
    
      
        
        
      
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